Dinding Sel Bakteri

PENDAHULUAN

Bakteri merupakan mikroorganisme bersel satu yang memiliki carakteristik yang bervariasi yang memungkinkan klasifikasinya. Satu skema klasifikasi utama adalah berdasarkan pewarnaan Gram. Pada prosedur ini bakteri dibunuh dengan pemanasan kemudian diwarnai dengan purple dye crystal violet dan iodium. Kombinasi ini membentuk kompleks celupan pada dinding sel bakteri. Perlakuan pewarnaan bakteri dengan sebuah dekolorisasi seperti etanol akan mencuci kompleks dari beberapa bakteri yang membedakan dari yang lain. Bakteri yang menahan kompleks kristal violet iodium terlihat ungu dan disebut “Gram positif”. Bakteri yang yang kehilangan kompleks celupan dapat diwarnai dengan celupan merah saffranin, terlihat merah dan disebut “Gram negatif”. Dasar dari reaksi Gram terjadi karena struktur diding sel yang akan dijelaskan dalam paper berikut.

Dalam paper ini juga akan dibahas tentang Bakteri penyebab TBC yang merupakan bakteri tahan asam yang memliki dinding sel yang unik. Bakteri ini pun dapat memiliki resistensi terhadap beberapa obat anti TBC.

 

PEMBAHASAN

Dinding Sel Bakteri

Berat dinding sel mencapai 40% berat kering sel bakteri. Dinding sel pada bakteri tersusun atas peptidoglikan berbeda dengan dinding sel tumbuhan (selulosa) atau dinding sel jamur (kitin).

 

Peptidoglikan merupakan polimer yang cukup besar, bahan penyusunnya berupa:

• N-asetil glukosamin
• Asam N-asetil muramat
• Peptida yang disusun empat atau lima asam amino, yaitu L-alanin, D-alanin, asam D-glutamat dan lisin atau asam diaminopimelat
• Komponen kimia lain seperti asam teikoat, protein, polisakarida, lipoprotein dan lipoposakarida yang terikat kuat pada peptidoglikan

Dinding sel pada bakteri berupa struktur kaku yang terletak di sebelah luar membran sel. Dinding sel berfungsi untuk :

• memberi bentuk pada sel
• memberi perlindungan
• berperan dalam reproduksi sel
• mengatur pertukaran zat dari dalam dan keluar sel. Dalam fungsinya membantu pertukaran zat; air, ion-ion dan molekul kecil dapat melintas dengan bebas melalui pori-pori kecil dalam dinding sel. Molekul besar seperti protein dan asam nukleat tidak dapat melalui pori-pori dengan bebas.

Kelompok bakteri ada yang memiliki dinding sel dan ada yang tidak. Bakteri yang berdinding sel sel dapat dibedakan berdasarkan hasil pengecatan Gram

Perbedaan utma dari dinding sel bakteri gram positif dengan dinding bakteri gram negatif adalah: pada bakteri gram positif tersusun atas lapisan peptidoglikan relatif tebal, dikelilingi lapisan teichoic acid dan pada beberapa species mempunyai lapisan polisakarida, sedangkan dinding sel bakteri gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan relatip tipis, dikelilingi lapisan lipoprotein, lipopolisakarida, fosfolipid dan beberapa protein.

Peptidoglikan (murein) yaitu susunan yang terdiri dari polimer besar dan terbuat dari N–asetil glukosamin dan asam N–asetil muramat yang saling berikatan silang (cross linking) dengan ikatan kovalen.

Berikut tabel perbedaan kandungan antara dinding sel bakteri gram positif dengan dinding sel bakteri gram negatif:

Beberapa kelompok prokariota, secara umum disebut archaebacteria, tidak memiliki lapisan peptidoglikan. Beberapa memiliki polimer yang sama mengandung gula N-acetyl. Pada archaebacteria lain juga terdapat lapisan protein.

Sel selama mensintesis peptidoglikan memerlukan ensim hidrolase dan sintetase. Untuk menjaga sintesis supaya normal, kegiatan kedua ensim ini harus seimbang satu sama lain. Bio-sintesis peptidoglikan berlangsung dalam beberapa stadium dan antibiotik pengganggu sintesis peptidoglikan aktif pada stadium yang berlainan. Sikloserin terutama menghambat ensim racemase dan sintetase yang berperan dalam pembentukan dipeptida. Vankomisin bekerja pada stadium kedua diikuti oleh basitrasin, ristosetin dan diakhiri oleh penisilin dan sefalosporin yaitu menghambat transpeptidase.

Diaminopimelic acid merupakan elemen unik pada dinding sel prokariotik. Bakteri mutan yang dihambat di tempat sebelum biosintesis zat ini, dapat tumbuh normal apabila dalam medianya tersedia. Jika hanya L-lisin, mereka mengalami lisis, karena pertumbuhan berjalan terus namun tidak mampu membuat dinding sel peptidoglikan baru.

Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).

Antibiotik yang menyebabkan gangguan sintesis lapisan ini aktivitasnya akan lebih nyata pada bakteri gram positif. Aktivitas penghambatan atau membinasakan hanya dilakukan selama pertumbuhan sel dan aktivitasnya dapat ditiadakan dengan menaikkan tekanan osmotik media untuk mencegah pecahnya sel. Bakteri tertentu seperti mikobakteriadan halobakteria mempunyai peptidoglikan relatip sedikit, sehingga kurang terpengaruh oleh antibiotik 

1. Bakteri tanpa dinding sel

• sering dianggap virus (ukuran terlalu kecil dan tidak adanya dinding sel). Tetapi memiliki struktur seperti prokariot berupa ribosom, DNA dan RNA
• dapat hidup tanpa dinding sel karena hidup pada habitat dengan tekanan osmotik yang terlindung seperti pada sel tubuh hewan
• Contoh : Mycoplasma pneumoniae (bakteri patogen pada hewan dan manusia)
• Kebanyakan Mycoplasma memiliki sterol pada membran yang kemungkinan berfungsi untuk menambah kekuatan dan kekakuan membran seperti pada membran sel eukariot

 

2. Gram Positif

• Memiliki lapisan peptidoglikan tebal berupa asam teikoat
• Dinding sel yang tebal tersebut menyerap kristal violet saat pewarnaan Gram sehingga berwarna ungu/biru
• Mengandung lebih sedikit asam amino
• Contoh : Bacillus thuringiensis

3. Gram Negatif

• Memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tipis
• Memiliki kandungan lipid lebih tinggi
• Memiliki membran luar yang melindungi dari lingkungan yang tidak menguntungkan
• Memiliki lipoposakarida (LPS) sebagai materi endotoksin yang banyak dimiliki bakteri patogen
• Terdapat ruang periplasma yang berisi air, nutrien, hasil sekresi (enzim pencerna dan protein transport)
• Contoh : Pseudomonas

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 

Genus Mycobacterium merupakan kelompok bakteri gram positip, berbentuk batang, berukuran lebih kecil dibandingkan bakteri lainnya. Genus ini mempunyai karakteristik unik karena dinding selnya kaya akan lipid dan lapisan tebal peptidoglikan yang mengandung arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat. Asam mikolat tidak biasa dijumpai pada bakteri dan hanya dijumpai pada dinding sel Mycobacterium dan Corynebacterium. Mycobacterium tuberculosis dibedakan dari sebagian besar bakteri dan mikobakteri lainnya karena bersifat patogen dan dapat berkembang biak dalam sel fagosit hewan dan manusia. Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis relatif lambat dibandingkan mycobakteri lainnya.

Mycobacterium tuberculosis tidak menghasilkan endo-toksin maupun eksotoksin. Bagian selubung Mycobacterium tuberculosis mempunyai sifat pertahanan khusus terhadap proses miko-bakterisidal sel hospes. Dinding sel yang kaya lipid akan melindungi mikobakteri dari proses fagolisosom, hal ini dapat menerangkan mengapa mikobakteri dapat hidup pada makrofag normal yang tidak teraktivasi.

Selain bersifat patogen Mycobacterium tuberculosis dapat berfungsi sebagai ajuvan yaitu komponen bakteri yang dapat meningkat-kan respon imun sel T dan sel B apabila dicampur dengan antigen terlarut. Ajuvan yang banyak digunakan dalam laboratorium adalah Freund's ajuvan yang terdiri dari Mycobacterium tuberculosis yang telah dimatikan dan disupensikan dalam minyak kemudian diemulsikan dengan antigen terlarut.

Mekanisme kerja obat antituberkulosis 

OAT yang akan dibahas dalam makalah ini adalah INH, RIF, PZA, EB dan SM. INH diduga bekerja dengan menghambat sintesis asam mikolat, komponen utama dinding sel Mycobacterium. RIF merupakan bakterisid yang bekerja menghambat sintesis asam nukleat yaitu sintesis RNA transkripsi dengan mengi-kat subunit β RNA polimerase. PZA merupakan analog struktur nikotinamid yang membunuh basil tuberkel semidorman dalam keadaan asam. Dalam keadaan asam, basil tuberkel menghasilkan pirazinamidase, suatu enzim yang merubah PZA menjadi asam pirazinoat, yang berfungsi sebagai antibakteri. EB mengganggu metabolisme karbohidrat, sedangkan SM membunuh bakteri dengan mengganggu sintesis prote-in, translasi, dengan berikatan pada 16s rRNA.

Mekanisme tingkat molekul resistensi terhadap obat antituberculosis isoniazid (INH)

INH merupakan antituberkulosis yang paling efektif baik untuk pengobatan maupun untuk pencegahan penyakit TB karena M. tuberculosis sangat sensitif terhadap INH. Galur resisten INH seringkali muncul dengan frekuensi kurang lebih 90%. Resistensi terha-dap INH disebabkan oleh mutasi pada salah satu dari gen katG, inhA atau ahpC.

Setelah masuk ke dalam sel, INH diubah menjadi bentuk aktifnya oleh enzim katalase-peroksidase (KatG) yang dikode oleh gen katG. Diduga, INH yang aktif berupa bentuk teroksidasinya. Enzim katG meru-pakan satu-satunya enzim yang mengaktivasi INH, oleh karena itu hilangnya aktivitas KatG akibat mutasi pada gen katG mengakibatkan M. tuberculosis resisten terhadap INH. Resistensi terhadap INH yang paling banyak terjadi adalah akibat mutasi pada gen katG. Yang banyak dilaporkan adalah mutasi pada kodon 315 (Ser → Thr) dan kodon 463 (Arg → Leu) Selain itu, juga ditemukan mutasi pada kodon 304 (Ile → Val) dan delesi parsial, di samping pada kodon 128 (Arg → Gln) dan kodon 291 (Ala → Pro), delesi sempurna pada gen katG dan perubahan pada urutan peregulasi inhA yaitu substitusi C209T.

INH dalam bentuk aktif menghambat enzim enoil-ACP reduktase, InhA (dikode gen inhA), suatu enzim yang mengkatalisis tahap awal sintesis asam mikolat. Reaksi yang dikatalisis oleh KatG terhadap INH diduga meng-hasilkan spesi elektrofil yang dapat bereaksi dengan molekul sasaran dalam sel Mycobacterium seperti InhA. Penelitian dengan pendekatan struktur menun-jukkan bahwa INH-aktif bereaksi dengan NAD(H), suatu kofaktor yang terikat pada InhA kemudian membentuk ikatan kovalen INH-NAD. Kepekaan terhadap INH disebabkan karena penggabungan INH-NAD sehingga menghambat aktivitas enzimatik InhA. Mutasi pada inhA juga menyebabkan Mycobacterium menjadi resisten terhadap antituberkulosis lain yang struktur kimianya mirip INH yaitu etionamid. Mutasi pada gen inhA belum banyak dilaporkan, namun telah ditemukan mutasi pada kodon 94 (Ser → Ala) dan daerah regulasi, yaitu posisi 209 C→T.

Sekitar 16% isolat klinik yang resisten terhadap INH menunjukkan mutasi pada gen ahpC yang mengkode AhpC, suatu enzim alkil hidroperok-sidase yang berfungsi sebagai komponen reduktase antioksidan. Jika gen katG termutasi maka ekspresi ahpC mening-kat untuk mengatasi hilangnya fungsi KatG. Mutasi yang bertanggungjawab terhadap peningkatan ekspresi gen ahpC adalah pada daerah berukuran 105 pasangan basa yang berlokasi di antara oxyR-ahpC, biasanya terjadi pada frekuensi rendah berupa transisi G-C men-jadi A-T.

Rifampin (RIF)

Terjadinya resistensi terhadap RIF mencapai 95, umumnya terjadi akibat mutasi pada gen rpoB yang mengkode subunit β RNA polimerase, komponen penting dalam proses transkripsi. RIF terikat secara spesifik pada subunit β RNA polimerase sehingga transkripsi terhambat. Berbagai mutasi pada gen rpoB telah diketahui bertanggungjawab terhadap resistensi RIF, terbanyak terjadi pada kodon 526 (His → Asp) dan kodon 531 (Ser → Leu). Mutasi lain yang menyebabkan perubahan asam amino terjadi pada kodon 518 (Asn → Ser), kodon 513 (Gln → Leu) dan delesi sembilan nukleotida. Di Afrika Selatan ditemukan gen rpoB M. tuberculosis dengan kodon 531 termutasi (Ser →Trp). Di Vancouver, Mexico City dan New Delhi, isolat M. tuberculosis resisten RIF banyak yang mengalami mutasi pada kodon 526 (His → Arg), kodon 531 (Ser → Leu), dan kodon 516 (Asp → Val) (Sharma, M, 2000), mutasi yang berupa misens atau mutasi ganda. Ditemukan adanya mutasi gen katG pada kodon 505 (Phe → Leu), 511 (Leu → Pro), 516 (Asp → Ala), 525 (Thr → Asn), 526 (His → Tyr dan His → Leu), 531 (Ser → Trp) dan 533 (Leu → Pro). Mutasi delesi juga dilaporkan terjadi pada posisi 199 – 207, yaitu hilangnya urutan ATGGACCAG, yang menyebabkan tiga asam amino hilang, yaitu Met, Asp dan Gln dan pada kodon 354 terjadi delesi GGG, yang menyebabkan kehilangan asam amino Gly. Selain mutasi tersebut, ditemukan juga mutasi pada gen rpoB yang terletak di luar posisi yang biasanya terjadi yaitu pada kodon 395 (Arg → Gln), 232 (His → Tyr), 221 (Ser → Leu), 202 (Asp → Tyr), 202-203 (Asp → Phe), 91 (Met → Leu), 227-228 (Leu → Ser), dan 349-351 (Gln → Ser) (Schilke, K., 1999).

Pirazinamid (PZA)

PZA yang masuk ke dalam M. tuberculosis akan diubah menjadi bentuk aktif oleh enzim pirazinamidase (PZAase). Enzim PZAase dikode oleh gen pncA dan mutasi pada gen pncA menyebabkan aktivitas PZAase hilang sehingga M. tuberculosis resistensi terhadap PZA. Pada sejumlah isolat resisten PZA ditemukan mutasi berupa substitusi nukleotida, insersi, delesi, substitusi asam amino atau pergeseran kerangka baca, di antaranya pada kodon 118 Asn → Thr, insersi CG pada posisi 501, insersi CC pada posisi 403, delesi 8 pb pada kodon start, kodon 54 (Pro → Thr), insersi AG pada posisi 368, kodon 41 (Tyr → His), kodon 88 (Ser → stop kodon) dan insersi A pada posisi 301. Pada 70 isolat resisten PZA yang dikarakterisasi dalam suatu penelitian ditemukan 68 galur resisten tidak mengalami mutasi pada gen pncA. Kenyataan ini membuka kesempatan untuk menemukan gen selain pncA yang bertanggung jawab terhadap resistensi PZA. Dua galur lainnya tidak mempunyai aktivitas PZAase yang didu-ga berhubungan dengan mutasi misens, salah satunya mengalami mutasi gen pncA pada kodon 82 dan yang lain pada kodon 171 (Ala → Val). Selain itu ditemukan juga dua mutasi lain yang mengakibatkan substitusi fenilalanin oleh glisin pada posisi 80 (mutasi pada posisi 241, T → G), dan substitusi alanin oleh prolin pada posisi 171 (mutasi pada posisi 511, G → C).

Etambutol (EB)

Resistensi terhadap EB berkaitan dengan mutasi yang terjadi pada gen embB pengkode arabinosiltransferase yang terlibat dalam biosintesis arabinan, suatu kompo-nen arabinogalaktan pada dinding sel. Mutasi pada gen embB dapat menghambat polimerisasi dinding sel arabinan dan menyebabkan akumulasi karier lipid dekaprenol fosfoarabinosa. Diduga bahwa obat meng-ganggu transfer arabinosa pada aseptor dinding sel.

Isolat M. tuberculosis resisten paling umum mengala-mi mutasi pada gen embB pada kodon 306 atau 406 dimana terjadi substitusi asam amino. Pada kodon 306 dilaporkan adanya substitusi of menjadi Dr, ug atau Rer. Selain itu dilaporkan juga adanya mutasi pada kodon 285, 330 dan 630. Baik substitusi tunggal misalnya pada kodon 313 (sis → tan) maupun substitusi ganda yaitu pada kodon 319 (Tyr → Cys) dan pada kodon 328 (Asp → Tyr). Mutasi lain menga-kibatkan gen-gen pada operon iniBAC, operon yang terdiri atas gen iniA, iniB dan iniC, diekspresi lebih tinggi bila M. tuberculosis dipaparkan terhadap etam-butol secara in vitro.

Streptomisin (SM)

Mutasi yang menyertai resistensi SM diketahui berhu-bungan dengan gen 16S rRNA (rrs) dan gen protein ribosom S12 (rpsL), yang paling banyak mutasi pada gen rpsL dan umumnya terjadi pada kodon 43. 54% isolat resisten SM mengalami mutasi misens sehingga mengakibatkan substitusi asam amino pada kodon 43 (Lys → Arg). Mutasi pada kodon 88 gen rpsL juga ditemukan. Mutasi pada gen rrs terjadi pada dua daerah yaitu di sekitar nukleotida 530 dan 951 serta ditemukan trans-versi A → T pada posisi 513. Ditemukan isolat resisten SM yang mengalami substitusi C865 → G pada loop 912 gen rrs dan tidak ditemukan mutasi pada loop 530.

Konsekuensi mutasi terhadap aktivitas enzim

Mutasi dapat disebabkan oleh perubahan nukleotida pada titik tertentu (mutasi titik), hilangnya nukleotida baru pada satu titik (delesi mikro) atau pada fragmen besar DNA (delesi makro). Selain dapat terjadi pada daerah pengkode, mutasi dapat juga terjadi pada daerah yang bertanggung jawab terhadap regulasi ekspresi OAT sasaran atau enzim pengaktivasi OAT, misalnya pada promotor. Mutasi pada daerah promotor menga-kibatkan transkripsi tidak terjadi atau turun sehingga enzim tidak dapat atau hanya sedikit disintesis.

Mutasi pada daerah pengkode dapat menyebabkan substitusi asam amino pada protein dengan ukuran normal atau menghasilkan protein yang lebih pendek. Substitusi asam amino dengan sifat berbeda dapat menyebabkan protein kehilangan aktivitas enzimatis atau kehilangan aktivitas pengikatan. Beberapa contoh substitusi asam amino yang dapat menyebabkan kehila-ngan atau penurunan aktivitas enzimatis terjadi pada enzim KatG dan PZAase. KatG mutan mengalami perubahan Arg463 → Leu, dimana Arg yang bersifat basa, dan berukuran kecil menjadi Leu yang bersifat netral, hidrofob dan berukuran besar. Jadi perubahan ukuran dan muatan asam amino ini sangat bermakna sehingga KatG kehilangan aktivitas enzimatisnya. Contoh lain adalah pada enzim ce ase mutan yang mengalami perubahan Tyr41 → His, dimana kedua asam amino tersebut bersifat polar, namun telah terjadi perubahan muatan (Tyr bersifat netral, sedangkan His bersifat basa) Hilangnya aktivitas enzim juga dapat disebabkan oleh mutasi nonsens yang menyebabkan terjadi kodon stop pada Ser88, sehingga enzim in ase yang dihasilkan menjadi lebih pendek dan tidak mempunyai aktivitas.

Substitusi asam amino juga dapat menghilangkan aktivitas pengikatan. Sebagai contoh terjadi pada enzim InhA, dimana terjadi substitusi Ser94 → Ala. Walau-pun kedua asam amino tersebut bersifat netral dan berukuran sangat kecil, tetapi terjadi perubahan polari-tas karena serin bersifat polar (hidrofil), sedangkan alanin bersifat tidak polar (hidrofob). Enzim InhA mutan tidak dapat diinhibisi oleh INH-NAD. Kegaga-lan pengikatan juga ditunjukkan oleh dua mutasi pada gen rpoB yang menghasilkan substitusi His → Asp pada posisi 526 dan Ser → Leu pada posisi 531. Perubahan His menjadi Asp tidak merubah sifat kepolaran dan hidrofilitasnya, melainkan merubah sifat keasamannya karena His bersifat basa, sedangkan Asp bersifat asam. Hal ini berbeda pada mutasi yang menyebabkan substitusi Ser531 → Leu karena kedua asam amino tersebut bersifat netral dan hidrofob, namun kepolarannya berbeda (Ser bersifat polar, sedangkan Leu bersifat tidak polar). Walaupun perubahan sifat asam amino pada kedua RpoB mutan berbeda, tetapi fenotip yang tampak adalah sama, yaitu keduanya menunjukkan aktivitas pengikatan yang menurun terhadap rifampisin. Substitusi asam amino pada enzim EmbB juga menyebabkan afinitas pengika-tan terhadap ethambutol juga hilang atau turun, yaitu perubahan Asp328 → Tyr, dimana kepolaran kedua asam amino tersebut tidak berubah, namun muatannya berubah (Asp bersifat asam, sedangkan Tyr bersifat netral).

Spain, T

Resistensi terhadap banyak OAT pada M. tuberculosis terjadi akibat mutasi yang tidak saling bergantung (independent mutation) pada lebih dari satu gen pengkode OAT dan atau gen pengkode enzim pengaktivasi prazat OAT. Mutasi yang terjadi dapat berupa substitusi asam amino dengan perubahan sifat atau struktur asam amino, perubahan kodon menjadi kodon stop sehingga enzim yang dihasilkan berukuran lebih pendek, perubahan kerangka baca akibat hilangnya atau penambahan nukleotida tertentu. Mutasi ini mengakibatkan protein target atau enzim pengaktivasi menjadi hilang aktivitas enzimatiknya atau aktivitas pengikatannya.